Занимательная статья:
РАЗЛИЧНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА ПТИЦ ПО ДНК И НАИБОЛЕЕ УСПЕШНЫЕ ИЗ НИХ ДЛЯ СОКОЛООБРАЗНЫХ FALCONIFORMES
О.Н. Нестеренко
Московский зоопарк
Одна из важных проблем в работе по разведению птиц в неволе – это определение их пола. Было подсчитано, что около 50% всех видов птиц не имеют полового диморфизма во взрослом состоянии. Определить пол птенцов по морфологическим признакам еще сложнее. Определение
пола птиц также важно при изучении их поведения, экологии, изучении эволюционных вопросов и многих других. Многие виды отряда Соколообразных стали редкими и нуждаются
в разведении в неволе. Однако одна из причин неудач при разведении в неволе этих видов – неправильно определенный пол. В последние годы активно развиваются различные методы определения пола птиц по ДНК. Определение пола птиц по ДНК удобно, так как можно определять пол птиц любого возраста, в том числе гнездовых птенцов, для определения достаточно капли крови, взятой на промокательную бумагу, пера (желательно кровяного растущего), можно
использовать скорлуповые оболочки яйца. Образцы для анализа могут долго храниться и перевозиться на большие расстояния. Однако существует несколько методов определения пола по ДНК, и существуют определенные проблемы в применении этих методов. В этой статье дается
краткий анализ разных методов определения пола птиц по ДНК и краткое описание наиболее успешных методов для представителей Falconiformes..
У птиц в отличие от млекопитающих гомогаметным полом являются самцы, их половые хромосомы обозначаются ZZ, а гетерогаметным полом - самки, их половые хромосомы обозначаются
ZW. Таким образом, различные методы определения пола птиц по ДНК основаны на определении последовательности характерной для W хромосомы. Различные авторы применяли разные методы для определения пола птиц по ДНК: гибридизация с олигонуклеотидным W- специфичным зондом (Dvorak et. al., 1992; Griffiths, Holland, 1990), RAPD (Griffiths and Tiwari, 1993; Lessells and Mateman, 1998), AFLP (Griffiths and Orr, 1999), амплификация микросателлитных и минисателлитных локусов
(Longmire et al., 1991; Miayaki et al., Wink et al., 1998).
Ряд авторов предложили способ определения пола птиц по гену
белка хромо-хеликаза (chromo-helicase DNA binding protein 1, CHD1), используя цепную полимеразную реакцию (ПЦР). Определение по этому гену получило широкое распространение. Этот ген находится как на W- хромосоме (CHDW), так и на Z-хромосоме (CHDZ). Также, как и другие гены – ген белка хромо-хеликазы состоит из кодирующих последовательностей – экзонов и некодирующих – интронов. Если экзоны весьма консервативны, то интроны имеют разную длину на CHDZ и CHDW. Таким образом, при амплификации участка гена, захватывающий
интрон, длина полученных в процессе амплификации ампликонов будет различна на Z и W хромосомах. И затем, после проведения электрофореза, можно видеть в ультрафиолетовом свете у самок две полосы, а у самцов – одну, так как ампликоны разной длины двигаются в геле под
воздействием тока с разной скоростью: более короткие двигаются быстрее, чем более длинные (Ellegren, 1996, Griffiths et al., 1998; Kahn et al., 1998, Fridolfsson and Ellegren, 1999).
Данный метод был заявлен, как подходящий для большей части видов птиц, он прост, быстр и недорог. Но при широком использовании был найден ряд проблем.
Во-первых, требуется до определенной степени модифицировать условия реакций и фореза для разных видов из-за генетических отличий разных видов (Lih-Chiann Wang et al., 2007). Для этого необходимо иметь образцы ДНК определяемых видов с известным полом, а это часто проблематично. Поэтому многие исследователи вынуждены работать при отсутствии контроля – образцов ДНК с известным полом данных видов. Что может приводить к ошибкам.
Другая проблема – пока плохо изучено, до какой степени данный метод подходит всем особям данного вида. Обычно метод проверяется на нескольких особях с известным полом. Но существует индивидуальная изменчивость, в результате которой, отдельные особи могут давать
ошибку при определении (Robertson et al., 2006). Так, у длиннохвостого песочника (Bartramia longicauda) был выявлен полиморфизм в CHD-Z интрон- регионе амплифицируемых праймерами P2/P8, предложенных Гриффитсом. В результате этого полиморфизма у некоторых особей, имеющих делеции в Z регионе, образовывались гетеродуплексы между Z’Z” фрагментами, в результате получался фрагмент примерно равный ампликону самок, в результате чего, эти особи самцов давали две полосы, характерные для самок и, соответственно, ложный ответ – самки (Casey et al., 2008). Иногда из-за конкуренции между праймерами может амплифицироваться достаточно ярко только одна полоса у самок вместо двух (Griffiths et al., 1998), но это возможно исправить правильным подбором условий.
И, наконец, одна из больших проблем – в результате ПЦР образуются близкие по размерам ампликоны – которые трудно отличить после проведении фореза. Это часто бывает у многих видов при применении праймеров P2/P8. В одних случаях, чтобы решить эту проблему, достаточно применять ПААГ (полиакриламидный гель), при этом для одних видов подходит 8%, для других нужно использовать 12% или даже 15% гель ПААГ, либо 6% (Nesterenko 2006). Возможно
применение SSSP (Griffiths et al., 1998), однако SSSP тоже имеет свои сложности.
Большая часть видов дневных хищных птиц дает близкие по размерам Z и W ампликоны при применении праймеров P2/P8, предложенных Гриффитсом с соавторами (Griffiths et al., 1998), как
подходящие для большей части видов килевых птиц. Так, для видов Accipitridae разница в длинах ДНК составляет обычно 2-8 пар нуклеотидов, поэтому эту разницу часто очень трудно уловить даже при продолжительных форезах в 12% и 15% ПААГ. А вот у Falconidae было определено, что разница между Z и W ампликонами составляет 20 пар нуклеотидов, таким образом разделить эти фрагменты в 8% ПААГ не составляет труда (Ito H., et al., 2003).
Разрешить проблему трудного определения пола для многих видов Accipitridae из-за маленькой разницы в длинах фрагментов, получаемых с Z и W хромосом можно используя метод ARMS ("амплификация рефракторной мутационной системы"). При использовании этого метода в реакционную смесь вводится сразу три праймера: P2, NP, MP. При этом NP/P2 амплифицирует фрагмент CHD1Z, а NP/MP амплифицировали специфичный для самок фрагмент (Ito H., et al., 2003; Reddy A., et al.,2007). Таким образом, даже при непродолжительных форезах можно
получать одну полосу для самцов, две – для самок Accipitridae, и три – для самок Falconidae. Можно использовать даже агарозный гель (Ito H. et al.,2003). В настоящее время этот метод применяется многими исследователями для определения пола птиц из отряда Falconiformes.
Исследуя ошибки при определении пола птиц с использованием CHD 1, как вызванных генетической изменчивостью видов и особей, так и техническими проблемами, Робертсон с соавторами (Robertson et al., 2005) предлагают использовать несколько разных молекулярных маркеров для определения пола. Lih-Chiann Wang с соавторами (Lih-Chiann Wang et al.,2007) исследовали успешность определения пола, используя интроны 1237L/1272H и 2550F/2718R для разных видов. По их данным интрон 1237L/1272H успешно применялся ими для определения пола у
Accipitridae. Они также предложили использовать для точного определения пола обе пары этих праймеров. При этом они успешно определили пол птиц 73 видов, принадлежащих 19 семействам.
